隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)藥物已成為生物技術(shù)新藥的主要品種。如促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素（EPO）、粒細(xì)胞集落刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、干擾素、白介素、胰島素以及各種疫苗等。目前已有４０種以上重要的治療藥物上市，７２０多種生物技術(shù)藥物正進(jìn)行Ⅰ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)或接受ＦＤＡ審評(píng)，其中２００種以上的藥物進(jìn)人最后的批準(zhǔn)階段。但是蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會(huì)被快速清除，這是由于組織中大量存在的蛋白酶，能夠水解蛋白質(zhì)藥物，使其喪失活性，同時(shí)由于腎小球的濾過(guò)作用，分子量小于６９ｋＤａ的分子在代謝過(guò)程中易被清除，肝臟在藥物代謝過(guò)程中也具有重要作用， 因而蛋白質(zhì)藥物半衰期都很短。為了維持一定的療效需要大劑量頻繁用藥，長(zhǎng)期的反復(fù)注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。因此臨床上需要研制長(zhǎng)效的蛋白質(zhì)藥物。目前，已經(jīng)建立的改善蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù)包括：蛋白藥物的化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化／納米粒、糖基化、構(gòu)建抗蛋白酶突變體等。本文將上述五種技術(shù)用于蛋白質(zhì)藥物長(zhǎng)效化的研究進(jìn)展作一綜述。

1、  化學(xué)修飾

化學(xué)修飾是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物半衰期的一個(gè)有效途徑。它是一種將分子量小的蛋白質(zhì)藥物共價(jià)連接到具有較大分子量的分子上，例如聚乙二醇和白蛋白，共價(jià)連接到大分子上能減小免疫原性，改善可溶性和生物學(xué)利用度，以及增加抗蛋白水解作用，同時(shí)也能夠延長(zhǎng)半衰期。然而，生物活性分子共價(jià)修飾的作用被內(nèi)在生物活性的損失所限制，例如，由于空間位阻而使受體結(jié)合減少，無(wú)活性分子整合到活性肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)而產(chǎn)生的異質(zhì)性。終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性通常伴隨著功能異質(zhì)性，致使生物活性或酶活性減小。聚乙二醇是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，ＰＥＧ類修飾劑和其他修飾劑相比，具有無(wú)毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相對(duì)分子量范圍寬，選擇余地大等優(yōu)點(diǎn)。而且ＰＥＧ可以將它的許多優(yōu)良特性賦予修飾后的生物分子。經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后，蛋白質(zhì)藥物的相對(duì)分子質(zhì)量有所增加，減少了藥物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的穩(wěn)定性，降低免疫原性，這些改變均有利于延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，從而，蛋白質(zhì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效性質(zhì)得到明顯改善。例如，ＰＥＧ修飾的干擾素α（ＩＦＮ-α）與未修飾的ＩＦＮ-α相比，半衰期延長(zhǎng)１０～２０倍；超氧化物歧化酶ＰＥＧ修飾前半衰期為５ｍｉｎ，ＰＥＧ修飾后半衰期延長(zhǎng)至４．２ｈ。用ＰＥＧ５０００修飾胰高血糖素，然后檢驗(yàn)此種修飾對(duì)胰高血糖素的構(gòu)象和生物學(xué)穩(wěn)定性的影響。檢測(cè)胰高血糖素樣品和 Ｐ Ｅ Ｇ修飾的胰高血糖素的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并評(píng)估其物理穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)修飾的胰高血糖素，分子間形成了許多β折疊結(jié)構(gòu)，成纖維的延遲時(shí)間短；而ＰＥＧ修飾后的胰高血糖素只有少量的分子間β折疊，并未出現(xiàn)纖維，物理穩(wěn)定性明顯高于前者。

迄今為止，國(guó)外已有多種ＰＥＧ修飾的蛋白質(zhì)類藥物應(yīng)用于臨床。目前已經(jīng)上市的ＰＥＧ化的蛋白藥物有ＰＥＧ化的Ｌ-天冬酰胺酶（Ｅｎｚｏｎ公司的Ｏｎｃａｓｐａｒ）、

ＰＥＧ化的干擾素αｂ （ＩＦＮ-α、ｂ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ公司的ＰＥＧＩｎｔｒｏｎ）、ＰＥＧ化的干擾素αａ （ＩＦＮα-ａ）（Ｒｏｃｈｅ公司的Ｐｅｇａｓｙｓ）和ＰＥＧ化的粒細(xì)胞集落刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）（Ａｍｇｅｎ公司的Ｎｅｕｌａｓｔａ）。

2、  蛋白質(zhì)融合

應(yīng)用蛋白質(zhì)融合能夠構(gòu)建具有雙功能的目的蛋白，這種融合蛋白是將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物。在分子水平，這個(gè)技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單靈活的特性，因?yàn)闃?gòu)建突變體時(shí)不需要插入連接序列而直接在Ｃ端或Ｎ端融合。因此，這種技術(shù)能廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建生物活性分子，而且它的應(yīng)用性不會(huì)因?yàn)樯锓肿拥拇笮』蚧钚远艿较拗啤３＿x用半衰期較長(zhǎng)，分子量較大的分子作為載體構(gòu)建融合蛋白，人血清白蛋白（ＨＳＡ）或免疫球蛋白（ＩｇＧ）的Ｆｃ片段應(yīng)用最為廣泛。故以人血清白蛋白和Ｆｃ片段的融合技術(shù)為代表進(jìn)行闡述。

人血清白蛋白是血漿中含量最多的蛋白，分子量６７ｋＤａ，它在血管和血管外室的循環(huán)中分布廣，半衰期可達(dá)到１９天，且結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，無(wú)明顯的免疫原性，是血液中重要的物質(zhì)輸送和藥物運(yùn)輸載體，所以它成為藥物設(shè)計(jì)理想的載體蛋白， 用于改善藥物的半衰期，延遲藥物清除，增加藥物暴露，減少注射頻率，改善病人對(duì)治療的順從性和耐受性。目前，多種蛋白與ＨＳＡ融合后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)得到了證實(shí)，例如成功地將白蛋白與激素（胰島素、天然胰高血糖素、人生長(zhǎng)激素）、細(xì)胞因子（干擾素α-２ｂ、ＩＬ２） 等融合，獲得更穩(wěn)定的循環(huán)蛋白，融合蛋白同時(shí)具有人血清白蛋白的長(zhǎng)半衰期， 和生物學(xué)活性及治療特性。通過(guò)此技術(shù)已對(duì)許多蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造。人胰島素／白蛋白融合蛋白（Ａｌｂｕｌｉｎ）在小鼠體內(nèi)半衰期比天然胰島素提高了４２倍。在畢赤酵母中表達(dá)的胰高血糖樣肽素-１融合蛋白（ＧＬＰ-１／ＨＳＡ）在小鼠體內(nèi)的半衰期比單獨(dú)的ＧＬＰ-１延長(zhǎng)４倍。干擾素α融合蛋白（ＩＦＮ-α／ＨＳＡ）的半衰期比未融合的干擾素α（ＩＦＮ-α）延長(zhǎng)了大約１８倍。利用抗體Ｆｃ段所特有的生物學(xué)功能與某些多肽蛋白融合也可增加該蛋白質(zhì)的血漿半衰期。人ＩｇＧ免疫球蛋白是體內(nèi)的主要抗體，它的半衰期約為２０天。ＩｇＧ融合蛋白的構(gòu)建方式大多是將ＩｇＧ的Ｆｃ片段或ＣＨ片段的Ｎ端與活性蛋白的Ｃ端相連。Syntonix Pharmaceuticals公司開發(fā)的EPO-Fc為吸入制劑，目前正在對(duì)貧血患者進(jìn)行臨床I期試驗(yàn) ，該制劑可延長(zhǎng)半衰期和替代目前使用的注射劑，給藥方便。該制劑的顯著優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需反復(fù)注射 ，尤其是對(duì)未進(jìn)行透析或正在接受腹膜透析的慢性腎病患者優(yōu)點(diǎn)更顯著。在試驗(yàn)中該制劑顯示出良好的療效。

3、  微囊化

微囊化技術(shù)已廣泛用于增強(qiáng)治療因子的藥代動(dòng)力學(xué)特性，改進(jìn)藥物穩(wěn)定性以及使藥物靶向釋放等方面。用微囊包埋蛋白質(zhì)和多肽藥物，不僅可以通過(guò)緩釋作用實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效皮下注射制劑，而且可以通過(guò)微囊表面和粒徑的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)口服、黏膜給藥、吸入等新劑型。此技術(shù)的原理是將藥物活性部分包封于聚合層中，通過(guò)皮下或肌肉給藥，聚合層隨著時(shí)間減少，使藥物從微囊中緩慢持續(xù)釋放，這有利于穩(wěn)定藥物，減少胃腸道酶的破壞，改變其體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間。

現(xiàn)在蛋白質(zhì)藥物的微球注射制劑已經(jīng)研究成功并應(yīng)用于臨床。它是用生物可降解聚合物作為骨架材料包裹蛋白質(zhì)藥物制成直徑為１～２５０μｍ的可注射微球劑， 生物可降解聚合物主要包括淀粉、明膠、葡聚糖、白蛋白、聚乳酸（ＰＬＡ）、聚乳酸乙醇酸共聚物（ＰＬＧＡ）、聚鄰酯、聚內(nèi)酯和聚酐等。目前用于制備緩釋微球的骨架材料主要是ＰＬＧＡ和ＰＬＡ，其中又以ＰＬＧＡ更為常用。

此外，美杜莎持續(xù)釋放系統(tǒng)也被用于蛋白質(zhì)藥物緩釋過(guò)程中，它是由多聚Ｌ-谷氨酸骨架組成，帶有疏水的α生育酚分子，形成毫微球粒的膠體懸液。由于毫微球粒的疏水區(qū)域的藥物相互作用產(chǎn)生了持續(xù)釋放藥物的效果。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)藥物被生理溶液中內(nèi)源蛋白代替，導(dǎo)致藥物緩釋。蛋白質(zhì)藥物最高濃度顯著降低，藥物釋放明顯延長(zhǎng)。美杜莎持續(xù)釋放技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于靜脈注射ＩＬ-２和ＩＦＮ-α（２ｂ），臨床上已經(jīng)應(yīng)用于腎癌和丙型肝炎Ｃ的治療。

目前聚乳酸及其共聚物類緩釋制劑已經(jīng)上市的藥物有，促甲狀腺激素釋放激素ＴＲＨ類藥物-曲普瑞林ＰＬＧＡ緩釋微球，用于治療前列腺癌，可緩慢釋藥１個(gè)月，是第一個(gè)多肽微球產(chǎn)品。亮丙瑞林ＰＬＧＡ緩釋微球，主要用于前列腺癌及子宮內(nèi)膜異位癥，也可釋藥１個(gè)月。以后又有多種ＬＨＲＨ類似物的緩釋微球注射劑先后上市。還有不少蛋白質(zhì)藥物的緩釋微球注射劑正在實(shí)驗(yàn)室研究或動(dòng)物試驗(yàn)階段。

4、  抗蛋白酶突變體

生物藥物的蛋白酶水解作用是給藥技術(shù)發(fā)展中需要突破的重要障礙。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)很容易被內(nèi)源血清中或組織中蛋白酶分解，并且蛋白酶對(duì)蛋白的降解可以發(fā)生在吸收、分布及排泄等各個(gè)階段，這就直接影響藥物的體內(nèi)半衰期、生物利用度、血漿清除率等參數(shù)。將一個(gè)或多個(gè)抗蛋白水解突變體引入到生物活性分子上，是藥物設(shè)計(jì)和發(fā)展的研究焦點(diǎn)。體內(nèi)的穩(wěn)定作用也通過(guò)引入人造氨基酸類似物而達(dá)到。這些變體發(fā)生細(xì)小的構(gòu)象變化，導(dǎo)致增強(qiáng)抗蛋白水解作用。例如，通過(guò)取代蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中任意肽鍵，提高蛋白藥物抵抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性，在模擬肽的生物活性的基礎(chǔ)上，通過(guò)肽的骨架修飾，改變肽的主體結(jié)構(gòu)，是擬肽設(shè)計(jì)的目標(biāo)。為了提高核糖核酸酶Ａ（ＲＮａｓｅＡ）抵抗蛋白酶Ｋ和枯草桿菌蛋白酶水解的能力，通過(guò)定點(diǎn)突變，用Ｐｒｏ替代了Ａｌａ２０，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變體酶（Ａｌａ２０ＰｒｏＲＮａｓｅＡ）的構(gòu)象沒有發(fā)生明顯的變化，生物活性也和野生型ＲＮａｓｅＡ一樣， 但是抵抗蛋白酶水解的能力顯著增加。通過(guò)ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電泳結(jié)果顯示，蛋白酶水解常數(shù)下降２倍。

5、  糖基化

蛋白質(zhì)表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、生物活性和穩(wěn)定性等，并且，糖基化是某些蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必需的。對(duì)比治療性蛋白質(zhì)的糖基化形式和非糖基化形式，一方面蛋白質(zhì)藥物表面增加了側(cè)鏈，提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，阻礙蛋白酶對(duì)蛋白藥物的降解作用，另一方面使蛋白質(zhì)藥物分子量增大，減少腎小球?yàn)V過(guò)。促紅細(xì)胞生成素（ＥＰＯ）是一個(gè)高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，它含有３個(gè)Ｎ糖鏈和１個(gè)Ｏ糖鏈。構(gòu)建重組人促紅細(xì)胞生成蛋白，分別在３３和８８位各增加一個(gè)Ｎ糖基化位點(diǎn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組人ＥＰＯ的體內(nèi)半衰期是ＥＰＯ的３倍。重組人ＥＰＯ的Ｏ糖基化對(duì)于體內(nèi)外活性及清除速率作用無(wú)關(guān)，而Ｎ糖基化不完全的重組人ＥＰＯ體外活性正常，體內(nèi)活性則降低到體外活性的１／５００，且體內(nèi)清除率也明顯加快。因此，Ｎ糖基化對(duì)蛋白質(zhì)藥物的修飾有重要作用。重組人ＥＰＯ突變體（Ａｍｇｅｎ公司的Ａｒａｎｅｓｐ） 已經(jīng)研制成功并上市。

組織纖維蛋白溶酶原激活劑（ｔＰＡ） 在體循環(huán)中的清除率很高，半衰期僅為６ｍｉｎ。Ｋｅｙｔ等構(gòu)建了ｔＰＡ變體，發(fā)現(xiàn)突變體具有減少ｔＰＡ血漿清除率的特性，同時(shí)保持正常的纖維蛋白結(jié)合能力和血塊溶解活性。有效延長(zhǎng)半衰期的ｔＰＡ突變體是通過(guò)在Ｋｒｉｎｇｌｅ１處進(jìn)行糖基化修飾，用Ａｓｎ替代Ｔｈｒ１０３形成，即ＴｔＰＡ。隨后在２９６-２９９位置發(fā)生四等位基因替換反應(yīng)〔ＫＮＲＲ（２９６-２９９ ）ＡＡＡ〕形成突變體（ＴＫｔＰＡ）。ＴＫｔＰＡ表現(xiàn)出抗纖溶酶原激活劑抑制因子１的能力比ｔＰＡ高８０倍。ＴＫｔＰＡ延長(zhǎng)了體內(nèi)清除時(shí)間，能夠減小清除率，同時(shí)保持正常的凝血活性。因此可以作為有效的低劑量血栓溶解劑。

綜上所述，目前已經(jīng)發(fā)展了許多有效提高蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù)，各種蛋白質(zhì)藥物長(zhǎng)效化方法都能夠顯著改善生物制品的穩(wěn)定性，提高藥物的生物利用度，延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期。